La Bibliothèque du cardinal Mazarin comprenait un ensemble important (un peu plus de 2 000, si l'on exclut les 300 volumes de l'ancienne collection Brienne, qui sont des copies de pièces d'archives) de manuscrits médiévaux et modernes rédigés non seulement en latin (environ 900), mais aussi en grec, français, italien, espagnol, catalan, portugais, islandais et dans les principales langues orientales (hébreu, arabe, turc, persan, copte, syriaque).
Cette collection, léguée par le cardinal, en même temps que le reste de sa bibliothèque, au Collège des Quatre-Nations, ne constitue pas, pourtant, la base de l'actuel fonds des manuscrits de la Bibliothèque Mazarine. A la suite d'un accord imposé par le pouvoir royal en 1668, les manuscrits furent en effet "échangés" contre les ouvrages imprimés figurant en double dans la Bibliothèque royale. Ils se trouvent aujourd'hui dans les différents fonds du département des manuscrits de la Bibliothèque nationale de France et en constituent une des richesses.
A l'exception de quelques manuscrits acquis au XVIII^e siècle par les bibliothécaires du collège, le fonds actuel de manuscrits médiévaux et modernes de la Bibliothèque Mazarine provient essentiellement de confiscations révolutionnaires. L'abbé Leblond se servit largement dans le dépôt littéraire de Louis-la-Culture (rue Saint-Antoine) où la plupart des manuscrits provenant des établissements religieux parisiens avaient été rassemblés ; il obtint également les quelques manuscrits que conservait encore l'abbaye de Saint-Denis à la veille de la Révolution, s'attribua aussi des manuscrits présents dans les bibliothèques d'émigrés et profita de sa position de "commissaire pour la recherche des objets de science et d'arts dans la Belgique et dans les pays conquis par les armées du Nord et de Sambre-et-Meuse" pour enrichir la bibliothèque de manuscrits provenant de ces régions.
Aux XIX^e et XX^e siècles, quelques donations sont venus enrichir encore les collections de la Mazarine, essentiellement des papiers d'érudits (fonds Faugère, Thiébaut de Berneaud, Tastu, Lebrun, Demangeon-Perpillou, Laurain-Portemer...) mais également des manuscrits médiévaux et modernes (donation de Paul et Madeleine Faralicq, donation des héritiers de Julien LeRoy White...) ou des documents concernant l'histoire des Antilles (legs Marcel Chatillon), dont les archives de la Société des Amis des Noirs fondée en 1788 par Brissot et Clavière. Certains de ces fonds, encore en cours de traitement, ne sont pas entièrement consultables.

Les manuscrits de la Bibliothèque Mazarine, catalogués une première fois au cours du XIX^e siècle (notamment par Taranne et Thiébaut de Berneaud), ont fait l'objet vers 1880 d'un recatalogage, avec attribution de nouvelles cotes, par Auguste Molinier dont le résultat a été publié en quatre volumes (Catalogue des manuscrits de la Bibliothèque Mazarine par Auguste Molinier, préf. d'Alfred Franklin. Paris : Plon, 1885-1892). Cette publication a fait l'objet de suppléments, publiés ou non, dont le dernier a été rédigé par Pierre Ganault en 1993.
Aujourd'hui, les manuscrits de la Bibliothèque Mazarine sont recensés dans Calames (Catalogue Accessible en Ligne des Archives et Manuscrits de l'Enseignement Supérieur).